Иммуноферментный анализ – это иммунологический метод, используемый для обнаружения и измерения специфических белков, таких как антитела, антигены и гормоны в биологических образцах.
Как работает иммуноферментный анализ?
Иммуноферментный анализ основан на специфической реакции антиген-антитело и обычно включает иммобилизацию антител или антигенов на 96-луночной или 384-луночной пластине. Основные этапы иммуноферментного анализа:
- Иммобилизация целевых белков/антигенов на поверхности микропластинки;
- Смывание несвязанных/избыточных белков/антигенов с пластины;
- Добавление меченого антитела, которое впоследствии свяжет целевой антиген/белок, присутствующий в пластине;
- Смывание несвязанных (избыточных) антител с пластины;
- Добавление специфичных для фермента субстратов, которые вступят в реакцию с ферментом и дадут окрашенный продукт, который можно измерить колориметрически с помощью считывателя микропланшетов.
Пероксидаза (HRP) или щелочная фосфатаза являются распространенными ферментами, используемыми в иммуноферментном анализе в то время как субстраты включают тетраметилбензидин (TMB) и 2,2-азино-бис-3-этилбензтиазолин-6-сульфокислоту (ABTS). Как правило, предпочтителен двойной или тройной отбор проб, и для обеспечения биологически приемлемого диапазона обнаружения используются различные концентрации пробы.
Стандартная кривая
Для количественной оценки концентрации целевого антигена генерируется стандартная кривая с использованием известных концентраций антигена. Затем оптическая плотность (поглощение света продуктом реакции фермент-субстрат), полученная в результате колориметрического анализа, наносится на стандартную кривую для точного измерения уровня целевого антигена в биологическом образце.
Виды иммуноферментного анализа
Прямой иммуноферментный анализ
Целевой белок/антиген иммобилизуют на поверхности пластины, а затем добавляют меченое ферментом антитело, поднятое против целевой молекулы.
Колориметрическое определение выполняется после добавления подходящей подложки. Этот формат прост и требует меньше времени. Однако существует высокий экспериментальный фон из-за связывания всех целевых антигенов с поверхностью, в дополнение к трудностям с первичной маркировкой антител.
Непрямой иммуноферментный анализ
Целевой белок/антиген, иммобилизованный на поверхности пластины, инкубируют с первичным антителом, которое выращивают против целевой молекулы. Затем для обнаружения и количественной оценки используется вторичное антитело, меченное ферментом, сгенерированное против первичного антитела. Хотя этот формат более чувствителен, чем прямой иммуноферментный анализ, существует высокая вероятность ложноположительного обнаружения из-за перекрестного вторичного антитела.
Сэндвич ЭЛИЗА
Для этого формата иммуноферментного анализа требуются два антитела (антитело для захвата и антитело для обнаружения), полученные против различных эпитопов (специфического сайта связывания антител антигена) целевого белка/антигена.
Процедура включает в себя иммобилизацию антитела (антитела для захвата), поднятого против целевого антигена в микропланшете. Добавление биологического образца, содержащего целевой антиген, в пластину, который впоследствии свяжет иммобилизованное антитело, присутствующее в пластине. Добавление меченого ферментом антитела (антитела для обнаружения), которое впоследствии будет связываться с целевым антигеном, присутствующим в пластине, и добавление фермент-специфичных субстратов к пластине, которые будут реагировать с ферментом и производить окрашенный продукт для обнаружения. Этот формат включает в себя два антитела, обнаруживающие различные эпитопы молекулы-мишени, что делает ее очень специфичной.
Конкурентный иммуноферментный анализ
В этой процедуре эталонный антиген иммобилизуется на поверхности пластины, и биологический образец, предварительно инкубированный с определенным количеством меченого антитела, добавляется на пластину. Количество антигена, присутствующего в образце, будет определять количество несвязанных или свободных антител, доступных для связывания эталонного антигена в пластине. Этот формат особенно подходит для мишеней с низкой молекулярной массой.
В чем преимущества иммуноферментного анализа?
Основным преимуществом иммуноферментного анализа является высокая чувствительность и специфичность, пригодные для обнаружения молекул-мишеней даже на уровне пиктограмм. Он часто используется для высокопроизводительного скрининга из-за простых и менее сложных экспериментальных процедур.
Иммуноферментный анализ также может быть использован для количественного определения целевых молекул в различных образцах, включая сыворотку, плазму, мочу, слюну, экстракты клеток или тканей и т.д.
Каковы недостатки иммуноферментного анализа?
Поскольку количественная оценка основана на реакции фермент-субстрат, временные рамки для обнаружения очень короткие. Кроме того, только ограниченное количество информации, такой как наличие или количество молекулы-мишени, может быть получено с помощью иммуноферментного анализа. Информация, связанная с активностью молекулы, не может быть получена с помощью этого метода.
